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NMR测试样品的准备和处理
2 @( m, s1 ]1 s+ D6 s) j+ {+ x; ~+ N6 C8 O
1. 样品的体积
4 h+ B3 M2 _0 r+ x9 I: l
1 E# o2 ]0 d0 W' W+ i( n 现代超导谱仪一般使用5mm直径样品管，溶液体积0.5ml-0.7ml，至少0.4ml。早期作13C-NMR谱使用10mm直径样品管，溶液体积1.5-2ml。6 L$ @: A( G8 Y- n4 I" {$ F+ W$ E
在样品管中溶液的深度由两个因子决定，样品若超过一定高度，超过部分将会接收不到发射线圈发射的射频造成浪费；若太低则样品与空气磁化率的不同造成界面磁化率突变会影响样品中磁场的均匀性。' v( W3 Q# t& _ M; L8 g2 v
. Q/ j$ r1 ^! L- D, w
$ n( s: N$ x8 m, O2. 样品的浓度 7 s: ]$ x4 J0 \6 ~5 M+ L2 E
6 e; K) D5 P8 H% `7 c* m% f, O
由于核磁共振实验固有的低灵敏度，所以它需要比一般红外、紫外实验更大的样品量，这往往成为核磁共振技术在生物学中应用的一个关键问题。/ w8 k: v; I& |8 i2 _6 L' X B
* {9 D) B0 P$ X' x3 \: a" f( @. ~
对于质子磁共振波谱，样品浓度一般在10-2-10-4 M。在FT谱仪中通过多次波谱累加可以降低对最低浓度的要求，只要时间足够，在原则上对于一个分子量20000的蛋白质，可以得到1-3mg样品的1H核磁共振波谱。4 o9 n5 v2 E; I0 N& \/ J
* Q1 e6 |6 m1 Q& k& W 对于13C谱来说，由于13C的低灵敏度，样品浓度的最低限度是10-2M。对于一个分子量为20000的蛋白质，使用10mm直径的样品管，样品体积是1.5ml，则需要大约300mg的样品。
7 L) C. B3 r$ P+ D; ` B
) d2 n7 `" `+ T0 A# }天然小蛋白质 ∽5mM
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同位素标记的蛋白质 >1mM
4 M% B% T( ^% O0 _/ G+ s8 x* g- s" s# F% `3 v) U
3. 溶剂的选择1 x# i" ^, J; g) K% x; n2 { T
6 S- q" f' x, h+ S/ O
9 P3 N& r1 z. g# S! h 一个理想的溶剂必须满足以下的条件：
) X6 F* \0 |7 j* c4 Y2 g 1. 样品在其中有高溶解度；4 ^* J6 N* ~& c
2. 在我们所感兴趣的波谱范围内没有溶剂峰；4 |2 { u+ ]. m1 c
3. 在做变温实验的温度范围内保持液体状态。
# f+ e- K+ f2 T 通常使用一些氘代溶剂,。
, |, P# | w& Y7 b4 x
, M7 C0 r' \7 |" M! K# f4 V% A# @4. 减少溶剂峰的干扰 2 i" }, |5 a) f7 O( k2 R
5 f5 V% q1 d" @5 }7 l) M* U+ X采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用。
+ [2 b1 M7 K6 o
0 d+ G F. c* ?; a8 y氘代氯仿是一个很理想的溶剂，它既适合于1H，也适合于13C，在整个质子谱范围内透明，再加上化学性质惰性，便宜，所以是常用的溶剂, H2O 是生物分子最适宜的溶剂(90%H2O,10%D2O)。
/ { u6 Z" Q7 Q1 f R' T, X
% i" v' J% M9 Z' @3 S
# n3 s" l$ K P, v5. 蛋白质NMR研究的溶液条件* f5 E( I) Y( |1 D' }
8 o7 U6 D& K4 O9 F3 X } 选择的pH值尽量在偏酸性如pH 3~5，也可以稍为高一些，但尽量不要大于7。这是因为蛋白质中的酰胺质子NH在pH 3~5之间与水的交换最慢，在其他pH特别是7以上交换加快，导致NH的信号减弱甚至消失，而NH的信息对于蛋白质主链乃至侧链谱峰的认证都十分重要。& a% M& _! V5 l4 l$ i7 p; ^$ W5 A) f
* a- H# c5 F. J) s 缓冲体系的成份首先要保证蛋白质的稳定及高溶解度，蛋白质的浓度通常要求有数mM，小蛋白质最好有5 mM以上，大蛋白质起码也要有1 mM 。8 _6 c8 K* Z5 a: |1 d9 v0 U/ F
W: ?7 M3 q P C& s6 d其次要考虑缓冲液中其他成份对蛋白质谱图的干扰，在这方面磷酸盐缓冲液最好，其他的如Tris或乙酸等有机成份由于本身也有CH质子，其化学位移与蛋白质中的CH相近，因而有干扰，特别是缓冲液浓度较蛋白质高出很多时。
: Z0 d) c/ N% _2 ?如果作同核谱，最好能用氘代的Tris和乙酸等；作异核谱时影响相对小一些，但其他有机成份也应控制在数十mM内。2 D2 t2 f1 Z8 r8 j0 L9 x
. E& ~8 \$ M9 |2 s
无机盐浓度不宜大于数百mM ，否则会影响核磁谱仪探头的调谐。在样品溶液中不能有重金属离子污染，因有顺磁性会降低核磁信号的强度和分辨率，必要时可在透析液中加EDTA等除去。1 T+ t1 ^4 f( _: Z, C
2 f' a3 B. g0 U
) |% E- A2 g7 b; [6 N5 ?6. 样品的处理0 w0 [8 \0 p1 k# D" {
/ ]6 ^/ k% _* C3 ?9 E0 g; \9 c3 V+ { 离心：样品（特别是生物大分子）溶解后，应该离心除去可能的微小颗粒，以免影响匀场，降低分辨率。
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9 [ @: F* E f+ u2 o ~5 t 除氧：在高分辨结构和弛豫研究中除氧是极为重要的（特别是小分子），溶解在溶液中的分子氧具有顺磁性，它会极大的减少弛豫时间，必须将氧除去。' v9 R o3 z2 X/ \, V1 y
# I9 P6 x/ V' ~0 [5 W 除氧的方法通常有两种，一种叫冰冻－抽真空－融化: 即把样品放在NMR样品管内冰冻，然后抽真空，融化，重复上述过程四次，最后在真空中将管口封住。另一种方法是将氮气或氦气，氩气强迫通过整个样品体积把氧赶走。 |
发表于 2006-11-24 15:37:47
发表于 2007-10-19 12:59:48
