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氨基酸、小肽的分析鉴定一直是人们极其感兴趣的研究课题，其中质谱用的非常广泛。在上世纪六十年代，由于离子化技术的限制，质谱技术还只能在有机化合物小分子的结构测定中得到应用，到了七十年代，等离子解吸(plasma desorption, PD)的离子化技术，使得质谱测定分子量得范围扩大到几千道尔顿，80年代，快原子轰击(fast atom bombardment, FAB)电离技术的引入，并成功的测定了一个26肽的结构，从而使质谱技术应用于蛋白质和肽的结构测定变为现实。另外两种更新的技术：电喷雾电离(electroscopray ionization , ESI ) 和基质辅助的激光解吸电离(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)的引入，使质谱的应用更加广泛，但存在灵敏度很低及其它的一些例如背景峰干扰等缺点。还有一些研究者采用衍生物的质谱分析法进行分析，HPLC的分析方法，情况稍有改观，但仍不令人很满意。另外，对于测定肽类、蛋白质的结构最经典的分析手段就是X-射线晶体衍射，但这个方法要求样品要以晶体形式存在，但是许多的蛋白和肽类化合物在生物内的存在方式是在溶液中，对于这类化合物只有在溶液中测得的结构才可以称为样品在正常情况下的结构。这样就引入了用核磁共振波谱方法对这类化合物进行分析。核磁共振方法和X-射线同为解析生物大分子高分辨率三维结构的有效手段，时至今日，核磁共振实验方法在研究溶液条件下生物大分子的结构和功能方面取得了长足的进步，但是在结构解析上仍然不如X－射线晶体衍射法。它的主要弱点有三：首先灵敏度低。虽然高场谱仪加上低温探头能解决部分问题，但是对于大分子的体系灵敏度仍然是制约因素之一；其次，对于蛋白、肽类等较大的分子在测定的时候，需要同位素标记，相当昂贵。最后，现有的数据分析方法自动化程度不高，对大分子量体系的谱峰识别和归属工作量大。但是在生物大分子体系研究中，核磁共振方法有其独到之处：对样品没有辐射损伤；可以在接近生理环境的溶液条件下研究生物大分子体系。 运用二维核磁共振技术来进行大分子的结构确定时，要与计算机模拟结合起来测定，一般分为一下几个步骤进行： (1) 选择合适的温度，PH值及溶剂条件，在D2O和H2O中分别做COSY , DQF-COSY , Relay , TOCSY等一系列的二维核磁共振波谱实验。从而将一级结构确定出来。 为了使波谱简化，易被解析，核磁共振波谱实验首先在D2O中做。在D2O中主链上的酰胺基团及侧链上的活泼氢都可以被氘代，从而使自旋系统得以简化。然后再在H2O中做，在H2O中的化学位移相关图中将呈现酰胺质子和氨基酸残基中其它质子之间的J耦合关系。可以将全部自旋系统确定下来。 (2) 根据1H-1H之间的NOE效应来进行顺序识别，即确定质子属于一级结构中哪一个残基。这需要选择适当的温度和PH，记录H2O中的NOESY谱，使得在这种条件下主链酰胺质子和溶剂的交换速率足够慢，以至全部主链酰胺质子都能被观察到。 (3) 确定二级结构单元。二级结构单元的确定，主要根据在规则的二级结构中顺序识别的中等范围内的1H-1H短距离所引起的NOE。观测蛋白质中规则的二级结构单元，发现各种不同的二级结构单元都有其特征的1H-1H之间的短距离，而这些短距离足以在NOESY谱上引起NOE交叉峰。用主链质子间、主链质子和侧链质子间以及两侧链质子间的NOE数据绘制的对角图可以完整的表示出蛋白质中所测量到的距离约束。从而可以将二级结构确定出来。 此外，也可以根据化学位移的变化来确定二级结构单元，但这一方法只是在处于一种经验阶段，应用不是很广泛。 (4) 三级结构的确定
+ o6 z) f7 Z5 e( i; t& x 。主要根据NOE起始的增长速率和两个质子距离的6次方成反比这一事实。要选择不同的混合时间做一系列的NOESY谱，然后做NOE交叉峰的强度随τ m变化的曲线，选择适当混合时间的NOESY谱，它的混合时间足够短，不至于由于自旋扩散而影响NOE交叉峰的强度，然后根据这样的NOESY谱中交叉峰的强度及蛋白质结构中的标准距离，得到一个蛋白质中几十对，甚至几百对质子之间的距离的上限，至于质子和质子之间的距离的下限则为两原子的范德华半径之和。 根据这些从NOE得到的距离约束数据，来决定蛋白质的三级结构，目前采用下面的一些方法。 a 在已知二级结构单元的基础上，根据NOESY谱提供的远程的1H-1H距离的信息，来确定二级结构单元之间的相对距离，然后用计算机图像系统或球棒搭出模型。 b 用距离几何的方法，在欧几里德空间得到一个满足所有距离约束的近似模型，获得每个原子的笛卡儿坐标。 c 结合能量极小化方法，升温退火的方法和距离约束德分子动力学方法，进行结构修正。 对于小于1KDa的小肽类化合物，我们可以不用标记而直接采取常见的2D实验就可以把二级结构确定出来可以采用的实验如下表所示: 表1 肽类蛋白类常用2D-NMR 实验 2D同核实验 | 所获得信息 | 2D异核实验 | 所获得信息 | COSY |
| HMQC | 氨基酸残基内C、H连接 | DQF-COSY |
| HSQC | 氨基酸残基内C、H连接 | TOCSY | 氨基酸残基内的指认 | HMBC | 序列间的相关－通过羰基 | NOESY | 序列间的相关，顺序识别 |
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确定肽类化合物的结构要注意到肽类分子是由氨基酸通过肽键连接，其共振峰的指认就包括了两个方面，一个是单个氨基酸残基内磁性核化学位移的确定，即所谓的自旋系统的识别；另一个就是确定自旋系统的顺序连接关系，即氨基酸序列的识别。 对于自旋系统的识别，主要依赖于二维同核实验，每个氨基酸都是一个独立的自旋体系。可以通过二维同核实验，如COSY及TOCSY实验，将自旋系统识别出来，再与氨基酸再无规卷曲肽段中质子的化学位移相对照，得出氨基酸残基的种类。下表就是20种氨基酸残基的自旋系统。 表2 氨基酸残基在无规卷曲状态下质子的化学位移 残基 | NH | ɑH | βH | 其它 | Gly | 8.39 | 3.97 |
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| Ala | 8.25 | 4.35 | 1.39 |
| Val | 8.44 | 4.18 | 2.13 | γCH3 0.97,0.94 | Ile | 8.19 | 4.23 | 1.90 | γCH2 1.48,1.19;γCH3 0.95; δCH3 0.89 | Leu | 8.42 | 4.38 | 1.65,1.65 | γH 1.64;δCH3 0.94,0.90 | Pro |
| 4.44 | 2.28,2.02 | γCH2 2.03,2.03;δCH3 3.68,3.65 | Ser | 8.38 | 4.50 | 3.88, 3.88 |
| Thr | 8.24 | 4.35 | 4.22 | γ CH3 1.23 | Asp | 8.41 | 4.76 | 2.84, 2.75 |
| Glu | 8.37 | 4.29 | 2.09, 1.97 | γCH2 2.31, 2.28 | Lys | 8.41 | 4.36 | 1.85, 1.76 | γCH2 1.45, 1.45; δCH2 1.70, 1.70εCH2 3.02, 3.02; εNH3+ 7.52 | Arg | 8.27 | 4.38 | 1.89, 1.79 | γCH2 1.70, 1.70; δCH2 3.32, 3.32 NH 7.17, 6.62 | Asn | 8.75 | 4.75 | 2.83, 2.75 | γNH2 7.59, 6.91 | Gln | 8.41 | 4.37 | 2.13, 2.01 | CH2 2.38, 2.38; δNH2 6.87, 7.59 | Met | 8.42 | 4.52 | 2.15, 2.01 | γCH2 2.64, 2.64; εCH2 2.13 | Cys | 8.31 | 4.69 | 3.28, 2.96 |
| Trp | 8.09 | 4.70 | 3.32, 3.19 | 2H 7.24; 4H 7.65; 5H 7.17 6H 7.24; 7H 7.50; Nh 10.22 | Phe | 8.23 | 4.66 | 3.22, 2.99 | 2,6H 7.30; 3,5H 7.39; 4H 7.34 | Tyr | 8.18 | 4.60 | 3.13, 2.92 | 2,6H 7.15; 3,5H 6.86 | His | 8.41 | 4.63 | 3.26, 3.20 | 2H 8.12; 4H 7.14 |
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发表于 2007-6-14 16:41:33
