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[求助]请问15N标记蛋白做三维实验前应做哪些实验准备,万分感谢

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发表于 2010-5-26 10:29:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

本人以前是做多肽结构的,现有一90残基的15N标记蛋白想测结构,有些问题想请教做过的各位大师,请好心人指点,谢谢!

3 ^, s& s9 n, ]( m, S4 e, B

 

: D8 b. m; W% o! q H, x% t/ l

问题1:前期准备工作应做哪些?我现在知道的有以下几个,不知是否必要,

/ T& R# h/ T2 @; _* K6 j6 ]

1. 蛋白样品的1H90度(是否需要用zgpr压水)

* i6 E2 I% r0 `* o4 M# q T/ s. e

2.15N的90度

) Q/ f7 p7 Z# }( m* ~

3.1H-15N HSQC(是否必须?)

5 n% j% G8 G! P

 

0 L/ h( ^/ ` l# e/ |. i! ^* P

问题2:只是15N标记,要测的三维实验有哪些,我知道的有:15N-TOCSY,15N-NOESY,不知是否还需测HNHA,HNHB,我用CYANA算结构

/ p. x* r: d, v, F* R0 f

 

0 @/ r, T( a$ F

问题3:我的样品浓度能到1.5mM,不知ns设多少合适,一个三维实验大概需要多长时间?

1 [6 k% a, ]8 F4 A1 N m

 

: V' Z& ]5 q4 }6 `. Z

 

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发表于 2010-5-26 21:40:43 | 显示全部楼层

想做什么样的三维实验?90个残基,一般来说只用N15标记可能不够了,需要C13的标记,先解骨架的序列。

7 ? P7 a V5 \* t# T, B: Y

一般先做正常的二维HSQC,做buffer的筛选,得到一张分辨率足够好的图,每个信号都清楚,如果到1.5mM一般估计一次HSQC做4-8 Scan就够了,浓度差不多了。

+ p) v; m# C) {% ]

 

% Y( E- p5 p* R0 @

压水是肯定的了

1 z) a3 L) n, d' {% j9 q9 z- p9 a2 x, j

 

3 a3 t' ]( G0 V, O2 _2 H( C9 Z

你如果还没有筛选到buffer,就不要先做后面的了,没用

7 z) I' z6 Y t0 [! q
[此贴子已经被作者于2010-5-26 21:41:43编辑过]
8 e2 p! h9 F3 I0 s& a
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