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[求助]请问15N标记蛋白做三维实验前应做哪些实验准备,万分感谢

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发表于 2010-5-26 10:29:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

本人以前是做多肽结构的,现有一90残基的15N标记蛋白想测结构,有些问题想请教做过的各位大师,请好心人指点,谢谢!

/ g' z' P0 }, w% [" d5 Z

 

( ^: ^0 r% W' _/ Q/ d6 V+ L8 N7 g

问题1:前期准备工作应做哪些?我现在知道的有以下几个,不知是否必要,

8 F' e b2 F- T0 z

1. 蛋白样品的1H90度(是否需要用zgpr压水)

: s* n( W: _! H3 W! J

2.15N的90度

1 I, V8 z- Z7 L: s! t$ t

3.1H-15N HSQC(是否必须?)

& g B9 h* s( A, d

 

8 h) o v; b& {# j

问题2:只是15N标记,要测的三维实验有哪些,我知道的有:15N-TOCSY,15N-NOESY,不知是否还需测HNHA,HNHB,我用CYANA算结构

' X$ U$ z, R. _% m' A- D7 J

 

6 v0 S! C5 L* _, R G

问题3:我的样品浓度能到1.5mM,不知ns设多少合适,一个三维实验大概需要多长时间?

! `. N2 b+ R, M" j6 c

 

/ H/ E0 Q. U+ U/ \' d& ~

 

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发表于 2010-5-26 21:40:43 | 显示全部楼层

想做什么样的三维实验?90个残基,一般来说只用N15标记可能不够了,需要C13的标记,先解骨架的序列。

3 L0 L' ]2 e" ?! J

一般先做正常的二维HSQC,做buffer的筛选,得到一张分辨率足够好的图,每个信号都清楚,如果到1.5mM一般估计一次HSQC做4-8 Scan就够了,浓度差不多了。

! C1 @9 Z9 \2 ~7 K7 |) t

 

$ J; A9 q+ q6 ]6 h) j

压水是肯定的了

; z5 q! x; ~6 Q6 ~" {- Z0 m. f

 

' V! e8 b* A* R) G- \/ k8 Q d8 c

你如果还没有筛选到buffer,就不要先做后面的了,没用

/ ?* |! h' `4 C" p7 a0 w6 s3 n
[此贴子已经被作者于2010-5-26 21:41:43编辑过]
* L: M: y, z' L" p/ ~9 ]$ u" d2 s6 E
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